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... 中國科協第381期青年科學家論壇——新時期微生物學研究的「知」與「行」於2019年9月21日在西南大學舉行。本刊摘錄部分學者的主要觀點,以饗讀者。 ◆ ◆ ◆ 細胞色素P450酶及其還原伴侶研究 李盛英(山東大學微生物技術研究院,教授) 細胞色素P450單加氧酶是廣泛參與微生物天然產物生物合成的關鍵催化元件,其引入的氧化性基團對於生物活性與生物利用度的改善以及生物合成途徑的多樣化延伸具有重要作用。 通過若干微生物來源P450酶的酶學與酶工程研究,能將該類催化元件運用於藥物、能源、工業化學品等產品的生物智造。與此同時,通過系統研究微生物P450酶的還原伴侶的功能機制,不僅顛覆了「還原伴侶選擇不影響P450酶催化類型與選擇性」的傳統認識,而且率先提出了細菌I型P450酶最適還原伴侶的預測原則。 ◆ ◆ ◆ 調控細菌耐藥和復甦的關鍵分子機制研究 白凡(北京大學生命科學院,研究員) 細菌耐藥性是一種現象,具有同樣基因組的細菌群體通過異質性的基因表達產生了一個細胞亞群,稱為持留菌,它們能耐受抗生素治療。持留菌形成的機制是細菌學研究的熱點。之前,持留菌的形成歸因於細胞的休眠狀態和生長停滯。在這些生理情況下,儘管抗生素結合到了其作用靶點,但由於細胞的代謝緩慢,抗生素無法對細菌造成傷害。 在顯微鏡下,對耐藥細菌在撤除抗生素後復甦生長過程的單細胞進行觀測,發現每個持留菌表現出不同的休眠深度,從而調控持留菌復甦生長所需時間的快慢。進一步地對單細胞實時動態觀察,意外發現伴隨著細菌休眠深度的加深,細菌細胞內會出現明顯的「小黑點」。通過蛋白螢光標記和高通量質譜鑑定,這些小黑點被證明是大量蛋白質沉澱產生的聚合體。 沉澱聚合體的形成,導致細菌進入深度休眠狀態;而當細菌需要復甦生長時,沉澱聚合體需要解聚,恢復細菌細胞內的蛋白質平衡分布。之後,通過大量的單細胞實時螢光成像和分子生物學實驗,深入揭示細菌細胞內ATP的耗竭是導致蛋白質沉澱聚合體產生的分子機制。當ATP得到補充,細菌準備復甦生長時,還需要兩個重要的蛋白DnaK和ClpB協助沉澱聚合體的解聚。 ◆ ◆ ◆ 海洋酸化抑制束毛藻的固氮作用 史大林(廈門大學環境與生態學院,教授) 浮游植物在海洋和全球碳循環中扮演著舉足輕重的角色。氮是浮游植物生長所必需的元素,其缺乏限制了全球面積一半以上海區的初級生產力。束毛藻是海洋生態系統中「新氮」的重要來源之一,可貢獻高達50%的全球海洋總固氮量,對海洋初級生產力以及碳、氮生物地球化學循環起著至關重要的作用。 工業革命以來,近三分之一人類活動排放的二氧化碳(CO2)進入海洋,導致其正以迄今3億年以來最快的速度酸化。海洋酸化將怎樣影響束毛藻的固氮作用以及其碳、氮生物地球化學效應和氣候效應如何,是國際海洋全球變化研究的熱點和焦點。 研究發現,在束毛藻生活的寡營養海區,痕量金屬鐵是其生長和固氮作用最重要的限制因子之一。CO2升高對束毛藻固氮的促進作用弱於海水pH下降對其的抑制作用,導致海洋酸化的凈效應為抑制束毛藻固氮,且該負效應隨著海水中鐵濃度的下降而增強。實驗表明,藻細胞內的pH隨著海水pH的下降而下降,束毛藻上調固氮酶的表達以應對由此引起的固氮速率降低,同時加大能量生產用以維持細胞內的pH穩態。鑒於固氮酶合成和能量生產過程對鐵的高度需求,鐵限制條件加劇了酸化的負效應。 我們預測,如果人為CO2排放量繼續上升,酸化將使本世紀全球束毛藻氮固定潛力降低27%,其中限制鐵的區域降幅最大。 ◆ ◆ ◆ 細菌受體感知細胞內外信息的生化機制 錢韋(中國科學院微生物研究所,研究員) 大部分微生物是不致病的,只有400多種是病原微生物,其中還有一些是條件致病菌,但是在微生物受到外界一定的刺激時,其很有可能轉變為病原微生物。組氨酸激酶是細菌感受刺激的主要受體,由組氨酸激酶和反應調節因子組成的雙組分信號系統是主要的細菌感知和反應機制。組氨酸激酶作為受體,通過自磷酸化檢測環境和細胞間刺激,磷酸化同源反應調節因子,引起適應性反應。雙組分信號系統幾乎調節細菌細胞的所有生理過程,包括群體感應、滲透壓、應激反應和毒力。 主要以動物病原和植物病原為對象,對細菌感知刺激進行了研究。研究發現,細菌感知刺激和信號具有多樣性,包括感知自身、感知寄主、感知細胞生存狀態與感知環境。感知自身是對群體感應信號的接收,感知寄主方面,細菌可以跨界感知植物激素——細胞分裂素,感知細胞生存狀態主要是組氨酸激酶感知環二鳥苷單磷酸(c-di-GMP)並控制細菌遊動性——毒力生存方式的轉變。 在這其中一個名為RavS的受體在控制細菌生存方式轉變中發揮著重要作用:RavS是一種組氨酸激酶,當其處於高磷酸化水平時,控制細菌遊動,但抑制細菌的毒力;但當RavS處於低磷酸化水平時,雖然對毒力沒有控制作用,卻能抑制細菌的遊動性。因此,當細菌需要從自由生存狀態向毒性狀態轉變時,RavS的磷酸化水平必須下降到較低水平。 這一下降過程是由細菌細胞內第二信使分子環二鳥苷單磷酸(c-di-GMP)嚴格控制的:c-di-GMP直接接合到RavS的ATP酶區,顯著增強了它的磷酸轉移酶活性。在將磷酸基團「甩」給RavR(下游反應調節蛋白)以後,RavS的磷酸化水平自然回歸到較低水平,從而解除對細菌毒力因子表達的抑制作用。因此,c-di-GMP信號分子與受體RavS的相互作用是調控細菌自由生活向毒性轉變的關鍵環節。 ◆ ◆ ◆ 基於「裝配線」化學的模板化生物合成研究 劉文(中國科學院上海有機化學研究所,研究員) 由動植物或微生物產生的天然產物往往具有良好的抗菌、抗腫瘤、抗病毒或者免疫抑制等活性,在醫藥產業中占有重要地位。 有趣的是,在生物合成過程中,一些蛋白在組織和利用小分子原料形成結構複雜的天然產物時,猶如裝配線般高效有序,經由這種「模板化」的裝配方式合成的天然產物主要為聚酮和非核糖體聚肽類。其生物合成過程是「模板化裝配線酶學機制」的典型代表。 以聚酮為例,在一個最小的聚酮合酶(PKSs)模塊中,醯基轉移酶識別並上載小分子羧酸底物到硫酯化功能域上,再由酮基合成酶催化兩個底物之間發生克萊森縮合形成C-C鍵。非核糖體聚肽合成酶(NRPSs)催化過程與之相似,區別在於利用胺基酸作為底物,催化形成C-N鍵。 PKS和NRPSs的模塊之間可以進行置換和融合,進而產生更為複雜的雜合化合物。PKS/NRPSs形成了一條集前體聚合與修飾以及鏈延伸與終止為一體的裝配線,並且遵循非疊代的「單結構域單功能」規則。雖然以PKSs和NRPSs為代表的裝配線已經得到較為充分的研究, 然而,近年來,越來越多的特殊裝配線被發現,包括特殊的前體單元、裝配線上的化學修飾以及線下後修飾反應幾個方面。 ◆ ◆ ◆ 三維基因組DNA大片段編輯機制研究 吳強(癌基因及相關基因國家重點實驗室,研究員) 基因組編輯幾乎在生物學和醫學的每一個領域都有應用,並且已經滲透到社會的許多方面。其中,聚類規則間隔短回文重複序列(CRISPR/Cas9)系統以其方便、簡單、高效、低成本等優點在基因組編輯中得到了廣泛的應用。 動態三維基因組摺疊與DNA複製和修復、染色體易位、重組和分離、RNA轉錄、剪接和轉運等許多過程密切相關。為了探索三維基因組動力學,我們正開發利用雙重sgRNAs編程的CRISPR/Cas9進行DNA片段編輯的技術,該技術可致使各種染色體重排,包括DNA片段缺失、倒置、複製或循環、插入和易位。 自CRISPR/Cas9新一代基因編輯系統建立以來,人們普遍認為Cas9核酸酶切割DNA雙鏈是產生平頭末端的。 在最新研究中,通過體內(in vivo)的DNA片段編輯技術,並結合高通量測序及體外斷裂實驗,發現Cas9核酸酶切割DNA雙鏈能夠產生突出末端,而不僅僅是之前研究報導的平頭末端斷裂方式。同時,通過基因工程改造Cas9核酸酶,使其具有不同的突出末端切割模式。 這進一步證明了Cas9切割末端的多樣性。通過系統的CRISPR DNA片段編輯實驗,利用雙重sgRNAs編程的Cas9分析染色體重排的深序列連接,發現核苷酸插入是可預測的。 ◆ ◆ ◆ 細菌進化:基於序列的挖掘到功能的驗證 楊瑞馥(軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所,研究員) 獲取核酸序列並深入挖掘是研究細菌進化的主要手段,隨著序列大數據的積累,可以通過細菌全基因組關聯分析(BGWAS)將序列變異信息與表型進行關聯,進而可以設計實驗進行驗證。 從功能進化的角度理解細菌進化中表型的改變,了解序列分析在細菌進化研究中的意義以及從功能進化角度來理解和驗證,使我們能夠更好地理解細菌進化過程中變異的意義,為更好地利用變異規律來防治傳染病以及預測傳染病奠定基礎。 ◆ ◆ ◆ 睪丸酮叢毛單胞菌的趨化性 劉雙江(中國科學院微生物研究所,研究員) 睪丸酮叢毛單胞菌是從處理化工廢水的污水處理廠的污泥中分離獲得的。 研究發現該細菌對4-氯硝基苯、3-羥基苯甲酸,4-羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸、香草醛、龍膽酸、苯酚等化合物具有趨化性,對睪丸酮叢毛單胞菌20個MCP進行系統敲除,構建不具有趨化能力的CNB-1D20突變株;同時,通過逐個回補MCP的手段,系統鑑定了每一個MCP蛋白在感應不同芳環類化合物過程中的作用;進一步對甲基趨化受體蛋白MCP2201與不同化合物結合能力研究發現,MCP2201不能與芳環類化合物結合,而是與三羧酸循環(TCA)中間產物結合。 這是一類全新的細菌趨化途徑,即細菌可以通過感知TCA循環中間化合物實現對芳香類化合物的趨化。 ◆ ◆ ◆ TDF耐藥的發現與鑑定 黃愛龍(重慶醫科大學,教授) 替諾福韋(TDF)被稱為「高效、低耐藥」的抗病毒藥物,目前已成為B型肝炎治療的首選藥物,但是臨床上仍有少部分患者對TDF僅部分應答,關於「這種現象是否與TDF耐藥有關」的報導還十分罕見。 目前,我們觀察到一名白血病伴B型肝炎患者,該患者的治療過程包括化療、恩替卡韋(ETV)和TDF抗病毒治療等,然而在TDF治療3個月後發生了病毒學突破。為分析該患者是否發生了TDF耐藥,我們提取了病毒學突破之後的患者B型肝炎病毒(HBV)DNA,通過T-A克隆測序和深度測序分析了反轉錄酶區(RT)序列的變異情況,結果顯示RT區134、145、238、248位點發生了高頻突變。進一步,在HBV 1.1倍體質粒的基礎上構建了HBV RT區替換HBV表達質粒和多位點突變HBV表達質粒。 細胞藥物敏感實驗結果顯示,對於野生型HBV和134/145/238/248位點突變HBV,TDF的IC50分別為0.32±0.04μM和1.99±0.35μM,而RT替換突變HBV的TDF IC50則>25.6μM,表明這些位點的突變導致了比較明顯的耐藥現象。 同源建模分析發現,多位點突變導致蛋白活性位點產生一定的小幅度構象變化,引起RT對藥物的結合親和力減弱,而對脫氧核苷酸的結合親和力不變或增強,RT結合藥物的選擇性變差,進而可能產生耐藥性。 ◆ ◆ ◆ 結核分枝桿菌-宿主相互作用及新診斷標誌物篩選與臨床驗證 謝建平(西南大學生命科學學院現代生物醫藥研究所,研究員) 結核分枝桿菌感染導致的結核病仍然是全球單一致病菌感染死亡率最高的重大公共衛生威脅。全球每年1000多萬新髮結核病患者,每年有150萬人死於結核病,遠高於愛滋病。結核病現有診斷措施,無論是病原學還是免疫學診斷,在報告時間、成本、靈敏度和特異性等方面都亟需改進。 我們採用多種組學技術,包括基因組、轉錄組、蛋白質組、甲基化組、修飾組、單細胞轉錄組、抗體組等,從致病菌和宿主兩個方面,綜合利用全球結核病相關大數據,篩選獲得了結核病患者特異性的診斷標誌物分子及其組合,並在結核病患者臨床樣本中進行了雙盲考察,獲得了特異性、靈敏度都接近90%的檢測效果,能夠鑑別肺部其他感染、腫瘤。同時,這些標誌物分子還能夠監測結核病藥物治療效果,將為結核病防控提供更好的基礎技術支撐。 ◆ ◆ ◆ 抗非酒精性脂肪肝新型益生菌的發現與機制研究 劉宏偉(中國科學院微生物研究所,研究員) 全球非酒精性脂肪肝炎(NASH)發病率達3%5%。預測2030年內,NASH將超過乙型病毒肝炎,成為威脅人類健康的又一殺手。 腸道菌群已成為研發抗代謝性疾病新藥的新靶點。我們構建了結構多樣性豐富的食藥用真菌化合物庫,從中篩選獲得一個抗非酒精性脂肪肝的靈芝先導分子。進一步,通過結構改造優選獲得一個穩定性好、藥理作用顯著、安全低毒的藥物候選分子SA7。SA7抗脂肪肝作用與新藥奧貝膽酸相當,並具有控制體重增長、改善胰島素抵抗作用。 SA7作用機制新穎:靶向調節腸道菌群,促進丁酸產生菌、抑制條件致病菌,減少內毒素血癥、降低系統性炎癥,從而治療包括NASH的代謝綜合徵疾病。 (西南大學藥學院周濤、廖國建整理) 全文見《新時期微生物學研究的「知」與「行」》,論文已發表在《科技導報》2020年第2期。 ...

 

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